李小萌
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区分人or狗DNA与猪or狗DNA ，不可依赖肉眼视察、气息、DNA总量或通俗电泳条带直接判断。较可靠的做法是对统一份样本并行检测人、狗、猪三类物种特异性遗传标记：人标记阳性、猪标记阴性 ，支持保存人DNA；猪标记阳性、人标记阴性 ，支持保存猪DNA；狗标记阳性只能说明检测到狗DNA ，不可单独判断样本属于“人和狗”照旧“猪和狗”。
这里的“or”可以明确为“可能是某一物种 ，也可能是另一物种”。若是样本可能是混淆物 ，就应同时判断三种DNA是否保存 ，而不是把效果简朴归为二选一。最终效果还要团结阴性比照、阳性比照、扩增内控和重复检测 ，阻止把低浓度、抑制或污染误以为物种差别。
为什么狗DNA不可作为两类样本的区分依据
“人or狗DNA”和“猪or狗DNA”都包括狗DNA这一配合选项 ，因此狗特异性检测阳性后 ，仍然有两种主要可能：样本为人加狗 ，或者样本为猪加狗。真正有区分价值的是人特异性标记和猪特异性标记。
人、狗、猪物种标记的典范判读逻辑
| 可能的样本组成 |
人标记 |
狗标记 |
猪标记 |
效果诠释 |
| 人简单泉源 |
阳性 |
阴性 |
阴性 |
支持保存人DNA |
| 狗简单泉源 |
阴性 |
阳性 |
阴性 |
支持保存狗DNA |
| 猪简单泉源 |
阴性 |
阴性 |
阳性 |
支持保存猪DNA |
| 人和狗混淆 |
阳性 |
阳性 |
阴性 |
偏向人、狗混淆样本 |
| 猪和狗混淆 |
阴性 |
阳性 |
阳性 |
偏向猪、狗混淆样本 |
| 人、猪和狗混淆 |
阳性 |
阳性 |
阳性 |
可能为多物种混淆或交织污染 |
| 三种标记均未检出 |
阴性 |
阴性 |
阴性 |
不可直接扫除DNA ，需检查提取量和抑制情形 |
表中的“阳性”应明确为在实验室划定的判断阈值内检出目的标记 ，而不是仅凭一次模糊扩增曲线下结论。若样本量很少或已经严重降解 ，某一种物种标记未检出 ，可能只是检测迅速度不敷。
实验室通常接纳哪些区分要领
物种特异性PCR或实时荧光定量PCR
这是区分人、狗、猪DNA最直接的筛查方法。实验职员会为三种物种划分设计具有区分度的引物或探针 ，也可以在统一反应系统中举行多重检测。实时荧光定量PCR适合低浓度、片断较短或部分降解的样本 ，并能通过扩增曲线和内控判断效果是否可信。
这类检测主要回覆“样本中有没有人、狗或猪DNA” ，不可单独回覆“来自哪一个详细个体”。引物特异性、扩增效率、污染控制和实验室验证都很主要。通俗通用PCR只能说明某段DNA被扩增 ，若扩增片断巨细相同 ，不可仅凭电泳条带判断物种。
DNA测序和物种条形码
当样原泉源未知 ，或需要对PCR效果举行确认时 ，可以对线粒体12S、16S、细胞色素b或COI等区域举行测序。线粒体DNA通� ？奖词细� ，在毛发、骨骼碎片或加工样本中可能比部分核DNA更容易检出。
但线粒体标记通常只能用于物种或母系谱系判断 ，不可像个体识别用的核DNA标记那样直接确定唯一身份。简单泉源样本可接纳通例测序；人和狗、猪和狗等混淆样本可能爆发重叠信号 ，须要时需要多重扩增、深度测序或经由验证的宏条形码剖析。
STR和SNP个体识别
若是问题进一步涉及“是哪一小我私家、哪一只狗或哪一头猪” ，就不可停留在物种检测。确认物种后 ，应选择对应物种验证过的STR或SNP检测系统。人类样本通常使用人源STR系统 ，犬样本使用犬源STR或犬类SNP面板 ，猪样本则使用适用于猪的遗传标记。
物种筛查与个体识别是两个差别条理的问题。一个样本显示为狗DNA ，并不代表已经完成犬只身份确认；同样 ，检出人DNA也不即是完成小我私家身份认定。若样本是混淆物 ，还需要判断混淆比例、等位基因泉源以及是否保存降解或等位基因丧失。
差别使用场景下怎样选择计划
检测目的与适合要领的对应关系
| 使用场景 |
优先要领 |
主要能解决的问题 |
| 未知样本的简单物种判断 |
人、狗、猪三重物种特异性PCR或qPCR |
判断样本是否含有三类目的物种DNA |
| 疑似人和狗、猪和狗混淆样本 |
多重qPCR ，须要时团结测序 |
区分人标记和猪标记是否与狗标记同时保存 |
| 血液、唾液、组织或毛发等生物痕迹 |
物种筛查后再做响应STR或SNP |
先确定物种 ，再举行个体泉源剖析 |
| 肉制品或加工食物中的物种判别 |
短片断qPCR或DNA条形码 |
判断是否含有猪或其他目的动物因素 |
| 土壤、粪便或情形混淆样本 |
物种特异性检测 ，重大时团结测序 |
筛查多种泉源并处置惩罚抑制物影响 |
若是样原来自法医或争议场景 ，除检测要领外 ，还要关注取样纪录、封存历程、样本流转和实验室资质。食物检测则要特殊思量高温、腌制、酸碱处置惩罚对DNA片断的破损；情形样本则常含有会抑制PCR反应的腐殖质、胆汁因素或其他杂质。
检测效果最容易泛起的几种误判
- 把狗阳性当成最终分类效果：狗标记阳性只能证实检出狗DNA ，必需继续审查人标记和猪标记。
- 把单次阴性当成完全没有该物种：低模板、提取失败、DNA降解或PCR抑制都可能造成假阴性 ，应审查内控并在条件允许时重复提取。
- 把线粒体阳性当成个体身份确认：线粒体标记适合物种筛查 ，但区分统一物种内的差别个体时通常需要核DNA标记。
- 用扩增循环数直接盘算混淆比例：差别物种的靶标拷贝数、扩增效率和样本生涯状态可能差别 ，Ct值不可未经校准就等同于各物种含量。
- 忽略人为污染：采样职员、实验操作台、共用用具或包装接触都可能引入人DNA。人源信号尤其需要团结空缺比照和重复效果判断。
- 忽略样本类型：带毛囊的毛发通常比纯粹毛干更可能含有足量核DNA；熟食、陈腐血迹和袒露在湿润情形中的样本 ，DNA完整性可能显着下降。
一套较稳妥的送检流程
- 第1步：明确判断目的。先说明是判断简单物种 ，照旧确认人和狗、猪和狗的混淆情形；若是还要确认详细个体 ，应在委托时一并提出。
- 第2步：镌汰交织污染。划分包装样本 ，阻止徒手接触待检区域 ，并纪录样原泉源、生涯条件和取样时间。
- 第3步：并行检测三类物种标记。优先选择经由验证的人、狗、猪特异性PCR或qPCR系统 ，并设置提取空缺、扩增阴性比照、阳性比照和扩增内控。
- 第4步：对重大效果复核。泛起两种或三种物种同时阳性、曲线异�；蛐Ч胙九渚胺灼缰率� ，应重新提取 ，须要时换靶标或增添测序确认。
- 第5步：按用途追加个体识别。只有在物种效果可靠后 ，才选择响应物种的STR或SNP系统 ，阻止直接套用不适用的检测试剂。
焦点判断：在人or狗DNA与猪or狗DNA的较量中 ，狗DNA是两种可能性共有的部分 ，不可单独完成区分。最有用的判别组合是“人特异性标记＋狗特异性标记＋猪特异性标记”并行检测；若涉及混淆样本、个体身份或正式争议 ，还需要重复实验、测序或对应物种的STR/SNP剖析。
